直接膽紅素/間接膽紅素比值

基本信息

專科分類： 消化
檢查分類： 肝功能檢查
適用性別： 男女均適用
是否空腹： 　空腹
手術參考價： 10元
科　室： 消化

直接膽紅素/間接膽紅素比值檢查簡介

計算直接膽紅素與間接膽紅素之比值，有助于黃疸的類型和疾病的鑒別。

直接膽紅素/間接膽紅素比值檢查過程

原理：

（1）改良咖啡因（J-G）法的原理：血清中結合膽紅素可直接與重氮試劑反應，產生偶氮膽紅素；在同樣條件下，游離膽紅素需有加速劑使膽紅素氫鍵破壞后與重氮試劑反應。咖啡因、苯甲酸鈉為加速劑，醋酸鈉維持pH同時兼有加速作用。抗壞血酸（或疊氮鈉）破壞剩余重氮反應，終止結合膽紅素測定管的偶氮反應，防止游離膽紅素的緩慢反應。加入堿性酒石酸鈉使最大吸光度由530nm轉移到598nm，非膽紅素的黃色色素及其他紅與棕色色素產生的吸光度降至可略而不計，使靈敏度和特異性增加。最后形成的綠色是由藍色的堿性偶氮膽紅素和咖啡因與對氨基苯磺酸之間形成的黃色色素混合而成。

（2）膽紅素氧化酶法的原理：膽紅素氧化酶（BOD）催化膽紅素氧化，生成膽綠素，后者進一步氧化生成淡紫色化合物，在450nm波長比色，吸光度的下降值（△A）與血清膽紅素濃度呈正比。

試劑：

（1）改良咖啡因（J-G）法：

①咖啡因-苯甲酸鈉試劑：稱取無水醋酸鈉41.0g（或CH3COONa·3H2O63.0g），苯甲酸鈉38.0g，乙二胺四乙酸二鈉（EDT-ANa2）0.5g，溶于約500ml蒸餾水中，再加入咖啡因25.0g，攪拌使溶解（加入咖啡因后不能加熱溶解），用蒸餾水補足至1000ml，混勻。用濾紙過濾，置棕色瓶，室溫保存。

②堿性酒石酸鈉溶液：稱取氫氧化鈉75.0g，酒石酸鈉（Na2C4H4O6·H2O）263.0g，用蒸餾水溶解并補足至1000ml，混勻。置塑料瓶中，室溫保存。

③5.0g/L亞硝酸鈉溶液：稱取亞硝酸鈉（NaNO2）5.0g，用蒸餾水溶解并稀釋到100ml，混勻，置棕色瓶中，冰箱保存，穩定不少于3個月。作10倍稀釋成0.5g/L，貯冰箱穩定不少于2周。

④5.0g/L對氨基笨磺酸溶液：稱取對氨基苯磺酸（NH2C6H4SO3H·H2O）5.0g/L，溶于800ml蒸餾水中，加入濃鹽酸15ml，用蒸餾水補足至1000ml。

⑤重氮試劑：臨用前取5.0g/L亞硝酸鈉溶液0.5ml和5.0g/L對氨基苯磺酸溶液20ml混合。

⑥5.0g/L疊氮鈉溶液：稱取疊氮鈉0.5g，以蒸餾水溶解并稀釋至100ml。

⑦膽紅素標準液

A.一般用游離（非結合）膽紅素配制標準液，因此配制標準液的稀釋劑需含白蛋白。可用牛血清白蛋白（40g/L）或人血清代替人血清白蛋白。后者方法如下：收集無溶血、無黃疸、無脂濁的新鮮血清，混合，必要時可用濾菌器過濾。取過濾后的血清1ml，加入24ml新鮮生理鹽水，混合。在414nm波長，1cm光徑，以生理鹽水調零點，其吸光度應小于0.100；在460nm的吸光度應小于0.04。

B.配制標準液的膽紅素須符合下列標準：純膽紅素的氯仿溶液，在25℃條件下，光徑10±0.01mm，波長453mm，摩爾吸光系數應在60700±1600范圍內；改良J-G法偶氮膽紅素的摩爾吸光系數應在74380±866。

C.膽紅素貯存標準液，171μmol/L（10mg/dl）：準確稱取符合要求的膽紅素10mg，加入1ml二甲亞砜，用玻璃棒攪拌，使成混懸液。加入0.05mol/L碳酸鈉溶液2ml，使膽紅素完全溶解，移入100ml容量瓶中，以稀釋用血清洗滌數次并入容量瓶中，緩慢加入0.1mol/L鹽酸2ml，邊加邊搖（勿用力，以免產生氣泡）。最后以稀釋用血清補足至100ml。配制過程中應盡量避光，貯存容器用黑紙包裹。置4℃冰箱3天內有效，但要求配后盡快作標準曲線。

（2）膽紅素氧化酶法：

①0.1mol/LTris-HCl緩沖液（pH8.2：稱取Tris1.211g，膽酸鈉172.3mg，SDS432.6mg，溶于90ml蒸餾水中，在室溫（25～30℃）用1mol/L鹽酸調節pH至8.2（約用6ml），再加蒸餾水至100ml，置冰箱保存。此液含4mmol/L膽酸鈉、150mmol/LSDS。

②BOD溶液：如系凍干品，按說明書要求復溶，但復溶后冰箱保存不宜過長（約可保存1周）。如系液體（可能含有甘油），置冰箱或冰室可保存較長時間，BOD貯存液的酶活性一般在數千至1～2萬U/L，BOD工作液的酶活性可按反應液中BOD終濃度達0.3～1.0U/ml計算。

③膽紅素標準液：342μmol/L：按膽紅素測定J-G法配制，或市售合乎要求的標準液。

操作方法：

（1）改良咖啡因（J-G）法：按表1操作。

充分混勻后，波長600nm，對照管調零，讀取各管吸光度；或用蒸餾水調零，讀取測定管及對照管吸光度，用測定管吸光度與對照管吸光度之差（AU-AC），在標準曲線上查出相應的膽紅素濃度。

（2）膽紅素氧化酶法：按表2進行操作。

加入BOD溶液后立即混勻，置37℃水浴5min，用分光光度計，在450或460nm波長，蒸餾水調零，讀各管吸光度。用于對照管的比色杯與非對照管的比色杯不得混用。

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